银杏叶注射剂指纹图谱的研究

中药现代化的重要任务之一就是要建立一套客观的质量控制方法用以规范中药生产。中药注射剂多数为多组分制剂，其中未知非定量成分占有相当比例。为了确保中药注射剂的质量稳定和临床用药的安全，国家药品监督管理局拟首先在中药注射剂质量标准中引入指纹图谱技术要求。近年有关银杏叶及用其提取物的制剂的研究很多，特别是在提取工艺和含量测定方面。目前公认的银杏叶有效成分黄酮苷和萜类内酯，大多数上市的银杏叶口服制剂以黄酮苷作为含量测定指标，方法多以 HPLC法间接测定黄酮苷元（槲皮素、山奈酚和异鼠李素）为主。在大部分尚不清楚的情况下间接测定总成分含量还不能真正反映原药材和制剂质量的稳定，特别是中药注射剂。为此我们在多年对银杏叶化学成分和提取工艺研究的基础上，用HPLC法研究了银杏叶药材、注射剂中间体和注射剂三者的指纹图谱。这将有助于银杏叶药材的标准化种植，银杏叶提取物及其制剂的质量控制。

l　材料和方法

1.1　药品：银杏科银杏属银杏秋季绿叶，产于江苏省邳州铁富镇银杏叶种植园，采于1999年8月20日到9月20日，80℃以下风干，按《中华人民共和国药典》规定中药材取样法取样12批；银杏叶注射剂及其中间体为本课题组小试产品。

1.2　供试品的制备：称取干银杏叶50g放人圆底烧瓶中，加10倍量50％乙醇。水浴回流2h，吸出5mL回流液用甲醇定容至10ml容量瓶中，再吸取5mL，过TOYOPAK ODS柱，滤液即为液相样品（取银杏叶注射剂及其中间体适量用甲醇溶解备用。称取参照物芦丁5mg，用甲醇溶解并定容于10ml容量瓶中，再从中吸取1ml用甲醇定容至10ml容量瓶中，备用。

1.3　仪器、试剂与色谱条件：日本岛津 LC－10AT高效液相色谱仪，SPD-10A紫外检测仪；乙腈为色谱纯，磷酸为分析纯；色谱柱：Diamonsil C

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(5μm，4.6mm×250mm)；流动相：A（乙腈）－Ｂ（酸水，水磷酸＝100:1)进行梯度洗脱，85％～83％B(0～30min),83％～80％B(30～40min)，80％～75％B(40～60min)，75％～85％B（60～80min）；流速：1ml/min，进样量：20μL；检测波长：UV360nm。

2　指纹图谱及各项技术参数

2.1　指纹图谱：银杏叶药材、注射剂中间体和注射剂指纹图谱（略）。原药材成分比中间体和制剂更复杂，可以看到有40多个峰。

2.2　共有指纹峰的标定、共有指纹峰面积比值和非共有峰面积：共有指纹峰的标定是根据对12批样品测定基础上进行的。在此首先阐明对共有峰标定的理解：由于中药注射液的制备都是经过对原料药多步纯化制得的，因此原料药的指纹图与中间体和制剂的存在很大的差别（图略）。为了更好地阐明它们之间的相关性，制定原药材指纹图应突出其制剂中保留成分的分离，在对共有峰峰面积比值计算时应重点参考中间体指纹图谱中峰的构成。只有这样，才能尽可能排除原药材供试品指纹图谱中杂质峰对计算共有指纹峰技术参数的影响。根据指纹图谱的技术要求和以上的考虑，将原料药材的指纹图谱峰分为共有指纹区（15min以后）和杂质区（1min以前）进行统计，从12批样品图谱的共有指纹区可以选出20个共有峰，其中6号峰为芦了，应当说明的是：杂质区大多数峰也为原药材共有峰，其中最大峰的面积也小于5％。根据对12批样品测定的数据，以6号峰为参照计算共有峰面积比。12批样品非共有峰峰面积比均小于5％。

3　方法学考查

3.1　稳定性试验：取一新制备供试品溶液，连续测定6次，每次间隔2h，供试品0，2，4，6，8和10h的测定结果表明本万法稳定。

3.2　精密度试验：取一新制备供试品溶液，连续测定6次，对测定结果中各峰的相对保留时间和峰面积百分比进行了比较，占峰面积百分比5％以上峰的RSD＜3％。

3．3　重现性试验：取同一供试品，同法制备6个供试品溶液进行测定，对测定结果中各峰的相对保留时间和蜂面积百分比进行了比较，占峰面积百分比5％以上峰的RSD＜3％。

4　讨论

4．1　供试品的制备：供试品的制备是依据银杏叶标准提取物提取工艺中确定的方法进行的。为了最大程度的保留原有成分，并保证分析的顺利进行，花样品预处理时只使用了TOYOPAK ODS柱除去脂溶性杂质。

4.2　参照物的确定：银杏叶中有两类有效成分（黄酮苷类化合物和萜类内酯），它们的含量分别在含量测定项下进行了测定和规定。鉴于指纹图谱的目的是甄别原料和药品的真伪，为此，我们认为选定银杏叶中种类较多的黄酮苷类化合物（20种以上）为检验对象能够起到指纹鉴别的作用。芦丁是银杏叶中含有的一种黄酮苷类化合物，也是中国药品生物制品检定所确认的黄酮苷类标准物质，因此被选定为本指纹图谱技术要求的参照物。

4.3　检测波长选定UV360nm为大多数贫困苷类化合物的特征波长，也是芦丁的长波最大吸收波长。