叶片离体培养有望实现药用紫锥菊规模化培植

本报重庆讯 重庆邮电大学生物信息学院和重庆大学生物工程学院共同开展的重庆市科委自然科学基金项目“药用紫锥菊(Echiancea purpurea)叶片离体培养技术”研究为实现药用紫锥菊种苗工厂化快速繁殖提供了新途径。科研人员以药用紫锥菊叶片为外植体，利用组织培养的方法诱导愈伤组织，成功地使其再分化形成完整植株。该研究建立的紫锥菊离体叶片的最佳培养条件可实现种苗快速生根，且生根率很高。此前利用药用紫锥菊叶片进行组培技术的研究尚未见报道。

紫锥菊为多年生草本植物，其含有羟基酰胺、多糖、倍半萜、多炔类、咖啡酸衍生物、黄酮等多种活性成分。药理研究显示，原产于美洲的药用紫锥菊对免疫功能有促进作用，可用于感染、感冒、关节炎、肺结核、气管炎、扁桃体炎、湿疹等的治疗。近年来，该植物受到国际上的普遍重视，成为国际市场需求量最大的植物药之一。我国北京、沈阳、山东等地近两年从欧洲和美洲成功引种该植物。但是，由于传统的种子育苗繁殖方法存在种子采集困难、发芽率低、需要低温春化处理工艺等问题，生产有较大难度，难以实现规模化，不能满足日益增长的市场需求。因此，进行药用紫锥菊的组培快繁再生技术研究非常必要。

在研究中，科研人员在药用紫锥菊的种苗上采取较嫩的叶片，对其进行消毒处理后，将其接种到附加不同生长物质的培养基中，诱导其生长。研究中选用的诱导培养基为MS+吲哚-3-丁酸（0.5~3.0毫克/升）+萘乙酸（0.5~2.0毫克/升）+蔗糖（30克/升）+琼脂（7克/升）。增殖培养基为MS+吲哚-3-丁酸(0.2毫克/升)+6-苄基腺嘌呤（0.3~0.9毫克/升）+赤霉素(0.1~0.7毫克/升)+蔗糖（30克/升）+琼脂（7克/升）。生根培养基为1/2MS+吲哚-3-丁酸(0.5毫克/升)+萘乙酸(0.1毫克/升)+蔗糖（30克/升）+琼脂（7克/升）。培养温度（24±2）℃，光照强度2500勒克斯左右，光照时间12~14小时/天。

在接种8天后，叶片切口周围出现膨大致密的翠绿色愈伤组织。两周后，愈伤组织不断增殖，逐渐形成圆形颗粒状突起。3周后，圆形突起形成绿色不定芽，继而伸长形成小芽苗。平均每块外植体可诱导5～11芽苗，且都在切块的边缘排列。培养25天后可形成具有肥绿叶片的小芽苗。

研究表明，不同激素浓度对植物愈伤组织的诱导分化和植株再生有重要影响。研究人员通过对培养基中施加不同浓度的萘乙酸和吲哚-3-丁酸检验对叶片愈伤组织的影响。结果发现，药用紫锥菊的叶片适宜在MS+吲哚-3-丁酸(2毫克/升)+萘乙酸(1毫克/升)+蔗糖(30克/升)+琼脂(7克/升)培养基上分化成苗。

在增殖培养中，待芽伸长并长出绿色叶片时，科研人员将苗分割成单株，将其转接到增殖培养基上。20～25天后，小芽基部膨大，或增殖形成具有3～4个小芽的丛生芽，芽苗可长成3～5厘米的无根苗。一般30～35天继代培养1次。在继代培养中，需将大芽丛分割成小芽丛，剪去过长的叶片，或将其接种在新的增殖培养基上进行扩大繁殖，并适当增强光照强度，使苗生长健壮。不同的激素配比对丛生芽的出芽率有明显的影响。要保持芽苗长势良好，且分化出芽时不长愈伤组织，培养基应为MS+6-苄基腺嘌呤(0.7毫克/升)+赤霉素(0.5毫克/升)+吲哚-3-丁酸(0.2毫克/升)+蔗糖(30克/升)+琼脂(7克/升)。

据介绍，紫锥菊的试管苗生根较为容易，即将高3厘米以上的无根苗切下，将其转到生根培养基上培养。12天时开始发根，25天后全部生根率达99％。根的数量为8～12条，最长约3厘米，平均长1.2厘米。激素对紫锥菊生根也有一定影响。当培养基为1/2MS+萘乙酸（0.1毫克/升）+吲哚-3-丁酸（0.5毫克/升）+蔗糖(30克/升)+琼脂(7克/升)时，生根效果好，根系较发达。培养4周后，根数达8~12条，根长达3厘米左右。此时即可移栽。移栽前必须炼苗5~7天，即将苗取出，洗去附着在苗上的培养基，将其移栽到泥炭土及腐质土混合的基质中，并注意保温、保湿。该方法的成活率可达90％。试管苗移栽3～4周后就可长出新根、新叶。成活后，可按常规进行栽培管理。

另外，研究人员还对叶片和叶柄不同部位的诱导分化和增殖能力进行了对比，结果发现叶片和叶柄越幼嫩，分化增殖能力越强；叶柄的分化主要出现在基部，数目较少，成苗速度快，芽苗健壮；叶片分化一般取中下部为宜，所诱导的不定芽数目多，成苗较慢，芽苗较弱。

（李标 唐坤 王伯初）